【GeneFrontier】重组合无细胞蛋白合成系统（Reconstituted Cell-free Protein Synthesis System）PUREfrex®

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PUREfrex^® 试剂盒是在东京大学的Takuya Ueda教授所发明的PUREsystem* 技术基础上，新开发的一款重组合无细胞蛋白合成试剂盒。

该反应系统由蛋白、核糖体、氨基酸和、NTPs组成。进行蛋白表达仅需将编码目标蛋白的模板DNA或mRNA加入到反应体系中，然后孵育2-4小时即可完成反应，且无需担心高背景影响到下游应用。

本试剂盒是各组分经过纯化再重新组合而成，而非直接从大肠杆菌中提取，RNase、β-半乳糖苷酶以及脂多糖（LPS）污染已受到严格控制。PUREfrex^® 试剂盒中的所有蛋白组分都不带标签，因此目的蛋白可融合任意标签进行纯化和检测。

特点

◆可同时加入多种模板进行反应，以合成Fab（带二硫键）及多聚体等带二级结构的多肽

◆可合成活细胞难以合成的强毒性蛋白

◆可直接使用PCR产物作为模板DNA

◆单位体积内合成的蛋白量几乎恒定，不随反应体积变化而产生显著差异

◆操作简便，仅需在37℃孵育数小时

◆产品经优化升级，合成量大大提高

◆可合成带标签的蛋白用于下游纯化和检测

使用PUREfrex^® 系统进行蛋白合成

应用
制备蛋白	●原核蛋白 ● 膜蛋白 ● 含二硫键蛋白 ● 真核蛋白 ● 活性IgG^[1] ● 含有非天然氨基酸的蛋白
蛋白基础研究	● 蛋白间相互作用 ● 蛋白二级结构研究 ● 抗体高通量筛选
体外展示技术	● 核糖体展示技术 ● mRNA展示技术

无细胞表达的优势

◆无需制备克隆

◆无需考虑培养条件

◆无需考虑表达所需的诱导条件

◆来源于宿主的污染少

试剂盒组成

试剂	体积	成分说明^（3）可定制	保存温度
溶液 I (白盖)	125μL	氨基酸，核苷酸，tRNA和酶的底物等	-20°C
溶液 II (黑盖)	12.5μL	蛋白，保存于含30％甘油的缓冲液	-20°C or -80°C^（1）
溶液 III (红盖)	12.5μL×2	核糖体（20 μM）	-80°C^（1）
DHFR DNA（透明盖）^（2）	10 μL	对照DNA，含有编码大肠杆菌DHFR基因的PCR产物（20 ng/μL）	-20°C

使用前请置于-80°C保存

（1）剩余的溶液应快速在液氮、干冰或乙醇中冻结，并保存于-80℃。必要时分装剩余溶液，并尽可能避免反复冻融。

（2）50 μL反应体系中加入2.5 μL DHFR DNA。

（3）关于溶液I、溶液 II和溶液III，可根据客户需求，去除特定的成分，出售可定制试剂盒。

添加剂

DS supplement

加入本品能为二硫键形成创造最适的环境。含氧化型谷胱甘肽（GSSG）和作为二硫键异构酶的大肠杆菌DsbC，作为氧化剂创造氧化环境。

DnaK Mix

是高度纯化的大肠杆菌来源的DnaK、DnaJ、GrpE蛋白以适当的浓度比例预混后的溶液。通过在单独的PUREfrex^®反应液或添加了DS supplement合成蛋白时添加DnaK Mix，可以更易获得难以独自形成高级结构的活性蛋白。

GroE Mix

是高度纯化后的大肠杆菌来源的GroEL、GroES蛋白以适当的浓度比例预混后的溶液。

在PUREfrex^®反应液合成蛋白时添加GroE Mix，可以更易获得难以独自形成高级结构的活性蛋白。

产品列表

产品编号	产品名称	规格	备注信息
GFK-PF201-0.25-EX	PUREfrex^® 2.0	1 kit	供250 μL反应使用
GFK-PF201-0.25-5-EX	PUREfrex^® 2.0	1 kit	供250 μL×5次反应使用
GFK-PF213-0.25-EX	PUREfrex^® 2.1	1 kit	供250 μL反应使用
GFK-PF213-0.25-5-EX	PUREfrex^® 2.1	1 kit	供250 μL×5次反应使用
GFK-PF003-0.5-EX	DnaK Mix	1 kit	供500 μL反应使用
GFK-PF004-0.5-EX	GroE Mix	1 kit	供500 μL反应使用
GFK-PF005-0.5-EX	DS supplement	1 kit	供500 μL反应使用

备注：

PUREfrex^® 已升级到2.0，比第一代产品表达量更高，污染物水平更低；

PUREfrex^® 2.1比2.0更适合二硫键的形成。

PUREfrex^®定制试剂盒可按客户要求，在PUREfrex^® 1.0或2.0配方基础上进行定制。

上述试剂仅供实验研究用，不可用作“医药品”、“食品”、“临床诊断”等。

参考文献

[1] Murakami, S, et al.(2019). Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system. Scientific Reports, 9(1), 671.成功合成了IgG1，IgG2和IgG4的活性形式；抗HER2抗体曲妥珠单抗的峰值产量达124μg/mL。

[2] Natan, E., et al. (2018). Cotranslational protein assembly imposes evolutionary constraints on homomeric proteins. Nature structural & molecular biology, 25(3), 279.

[3] Kuruma, Y. & Ueda, T. (2016). Corrigendum: the pure system for the cell-free synthesis of membrane proteins. Nature Protocols, 11(3), 616.

[4] Murakami, H., et al. (2006). A highly flexible tRNA acylation method for non-natural polypeptide synthesis. Nature Methods, 3(5), 357-359.

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