【Cytiva】层析应用指南

应用领域：糖类分子

简介

糖蛋白，多糖，糖脂类生物分子的分离和纯化

研究方向:

病毒糖蛋白纯化

细胞膜表面糖蛋白的分离

膜囊泡的转运机制的研究

推荐层析方法

两种固定外源凝集素的亲和层析填料Con A和Lentil Lectin可以结合糖蛋白，多糖或者糖脂类分子。可以结合含有a-D-叱喃甘露糖，α-D-吡喃葡糖基等类似结构的分子，如果样品中需含有去垢剂，可选择Lentil Lectin填料去保证回收率。

应用领域：膜蛋白

简介

膜蛋白分离时用去污剂促进蛋白的溶解，提高其稳定性。

添加了标签的膜蛋白可以用对应标签蛋白纯化填料进行快速分离纯化，后续可以使用高分辨率的离子交换、疏水层析和凝胶过滤方法进行精细纯化。纯化后的样品，可通过蛋白印迹、光散射，凝胶过滤等方法进行分析和评估。

推荐层析方法

●标签蛋白纯化推荐按照下列标签蛋白纯化中的方法进行选择优化

●微量的样品处理、膜蛋白表达筛选、去污剂筛选等实验可使用His MultiTrap 96孔板，His Mag Sepharose Ni等小包装高通量方式进行●微量的样品纯化和鉴定可选择3.2/300和5/150柱型的分子筛填料，可参考凝胶过滤部分Superdex Increase柱型填料推荐

●高分辨率的填料可提供更高纯度的样品，如离子交换层析填料可选择Capto lmpres

系列、SOURCE和HiRes系列

●在离子交换实验中，注意选取的离子型去污剂需与目标蛋白携带相反电荷，避免其作为竞争物，降低载量

应用领域：科研/诊断抗体

简介

诊断应用: 体外诊断上游原料

科研应用: 免疫学实验/医学

样品来源: 动物腹水/血清/细胞培养液上清

●目标抗体的来源决定了需要采用不同的前处理方法去除污染物，经过离心或过滤后才可以进行亲和层析

●亲和层析捕获抗体后可以采用分子筛或离子交换进行杂质，如聚集体、宿主DNA等的去除

推荐层析方法

纯化路线:

●根据不同种属来源不同类型的抗体，主要是Fc区域与Protein A，Protein G的结合强度，选择Protein A或者Protein G配基的填料进行亲和层析，捕获抗体

●如果为了避免宿主IgG和血清蛋白的千扰，也可采用预活化填料如NHS-activated Sepharose等挂载可以特异性结合抗体的蛋白进行特异性捕获

●精纯。可以采用凝胶过滤层析柱Superdex 200去除抗体聚集体。也可采用阴阳离子交换进行去除聚集体、DNA、内毒素等杂质

应用领域：抗原

简介

利用IgG抗原与抗体的亲和作用进行分离

重组抗原的纯化路线参照重组蛋白

推荐层析方法

可直接选择IgG sepharose填料，或者使用活化偶联填料如CNBr，NHS-activted Sepharose FF填料偶联lgG或者特定抗体，再进一步捕获IgG抗原。

应用领域：重组标签蛋白

简介

重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想，可以通过亲和标签的作用一步实现高纯度的纯化

推荐层析方法

纯化路线

●含组氨酸标记(Histidine-tagged) 的融合蛋白: 组氨酸标签被广泛的使用，因为它们小，几乎不干扰靶蛋白的功能、活性和结构。可以用鳌合了二价金属离子的亲和填料捕获含组氨酸标签的融合蛋白，常用的有Ni Sepharose 6 FF/HP填料，如果您对纯度的要求比载量更高，可采用Talon柱，一种鳌合有Co²⁺离子的亲和填料，其对His标签蛋白的选择性高于传统的Ni柱

如果您的样品是真核细胞培养上清分泌表达的标签蛋白，例如昆虫细胞，CHO细胞，或者使传统IMAC填料金属离子脱落的样品，亦或是要在缓冲液中加入EDTA或还原剂去辅助样品的稳定，可以使用Ni Sepharose excel填料

●GST融合蛋白: 为了提高样品的溶解性，如果在上游构建时添加GST标签和标签去除的酶切位点，可利用Glutathione Sepharose 4 B/4 FF /HP作亲和层析捕获，再根据构建质粒时采用的不同的酶切位点选用凝血酶、Factor Xa或Precission酶去除标签

●MBP标签:可促进融合蛋白的可溶性表达。可利用MBPTrap HP预装柱或Dextrin Sepharose HP填料使用麦芽糖进行温和洗脱。MBP 标签大小为42.5 KD，在纯化后期需要用酶切去除，常用的内切酶是Factor Xa，麦芽糖酶和肠激酶

●Strep 标签: 可利用 Strep trap XT预装柱或者Strep-Tactin XT Sepharose进行亲和层析能够得到高纯度的蛋白样品。Strep标签是由八个不同氨基酸组成的，分子量较小可以不切标签

应用领域：包涵体蛋白

简介

包涵体蛋白往往需溶于6 M盐酸或8 M尿素中才能进行相关纯化，变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象，一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好

推荐层析方法

●高化学稳定性的Superose 12及Sepharose 6 FF凝胶过滤填料很适合在变性条件下做纯化

●Superdex 75 increase ,Capto Q和Capto Phenyl等填料对应的层析手段均可应用在包涵体蛋白复性中

●SOURCE 30 RPC 反相层析填料很适合纯化复性前的粗品，并可以1 M NaOH重生此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收率明显提高

应用领域：包涵体蛋白固相复性

简介

将包涵体蛋白在变性条件下固定(吸附)在层析填料上，一般用各种离子交换层析填料。去除变性剂后，蛋白在填料上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成，所以复性得率更高而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率

推荐层析方法

固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用，比一般试剂盒更方便、耐用

应用领域：天然产物TCM

简介

天然产物如中药的的成分极其复杂。在对原材料进行酸碱提取，热水，微波或者高压匀浆预处理后进行进一步纯化。有效成分包括生物碱、黄酮、蕙醒、皂武、有机酸、多糖、肽和蛋白质等。由于成分复杂，需灵活及综合性地利用多种层析方法，如离子交换、分子筛、反相层析，利用成分之间的不同性质差异，更容易分离到单一活性成分

推荐层析方法

●Sephadex LH -20 葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能，可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、武、黄酮、醒类、内脂、酷类、笛类等

●生物碱在酸性缓冲液中带正电，阳离子交换层析填料如SP Sepharose HP可以分离许多结构非常近似的生物碱

●有机酸:相反，黄酮、蕙醒、皂武、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，阴离子交换层析填料如Q Sepharose HP具有良好的分离效果

●多糖: 植物多糖:在前处理后，多采用离子交换层析和凝胶过滤层析结合进行分离纯化。离子交换层析步骤常用填料DEAE Sepharose,Q Sepharose等来分离多糖和蛋白并去除色素，凝胶过滤如SephacrylS300-1000,Sepharose CL 4 B/6 B或者Sephadex LH-20进行多组分多糖分离，如果需更高分辨率，可选择新一代的Superdex或者Superose基架的凝胶过滤填料。

●细菌英膜多糖:传统的苯酚抽提方法会对生产操作者的健康带来威胁，并会危害环境，其残留会影响制品的质量，也不适合大规模的工业化生产操作。可以采用层析法去提纯粗糖，分离多糖和蛋白。工艺中可采用capto adhere和captor DEAE两种层析介质串联，流穿模式进行纯化得到精糖

●SOURCE 15 /30 RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SOURCE 反相层析可用范围为pH 1-14，并可用1 M NaOH 、1 M HCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长

应用领域：肽类

简介

肽类的来源有天然提取，合成肽和重组肽三种。大多数多肽都是化学合成的，只有非常少的肽是来源于天然提取，更大的肽一般指超过25个氨基酸，需要通过重组DNA的技术表达生产。多胁的紫外吸收通常在206 nm -220 nm，如果含有芳香族的基团，紫外的吸收最大值会在268 nm-280 nm

推荐层析方法

●多肽耐有机溶剂，可用高选择性的反相层析如SOURCE 30 RPC、SOURCE 15 RPC

SOURCE 5 RPC或离子交换层析作纯化

●Superdex 30是专为分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，高化学稳定性，pH 1-14兼容有机溶剂(乙腈+TFA)，能配合反相层析做出更精美的肽图

●当分离的多肽带有电荷的时候，可以选择用离子交换层析进行分离，如HP、SOURCE、Minibeads、Monobeads等精细填料

●当分离的多肽带有电荷时，可以选择用离子交换层析如Capto lmpress、SOURCE HiRes等精细分离填料

应用领域：多盐

简介

样品预处理或者衔接不同层析手段之间样品处理，需要置换样品中的盐分或去除一些小分子。

推荐层析方法

使用凝胶过滤填料Sephadex G 10,G 15,G 25,等去除小分子，效率高，处理量可达柱床体积30%。只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料。

分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10 cm以上即可。整个过程一般可于数分种至半小时完成Sephadex G25系列填料专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap Desalting(5 mL)可用针筒操作。

HiPrep Desalting(26 mL)可在数分钟为多至10 mL样品脱盐。