【Transnetyx Tissue】Hibernate®A

Hibernate®-A和Hibernate®-E是无血清的基础营养培养基，用于短期维护培养的经元和在环境CO₂条件下保存活性脑组织。Hibernate®培养基使科学家在进行台面活细胞实验时拥有更大的便利性和控制，例如显微镜研究、流式细胞术和其他生理学研究。Hibernate®-A设计用于维护出生后和成人神经组织，而Hibernate®-E设计用于维护胚胎神经组织。活性脑组织可以在4°C的Hibernate®培养基中添加B-27®补充剂后存储长达1个月，然后再进行处理。在Neurobasal®培养基中添加B-27®补充剂并在5% CO₂孵育箱中培养神经元后，使用添加B-27®补充剂的Hibernate®-A或Hibernate®-E允许在环境CO₂（0.2%）中进行操作。神经元在环境CO₂水平下的Hibernate®培养基中可以维持至少2天的存活率。

● 添加了B-27的Hibernate®培养基可在2°C至8°C的条件下保存活脑组织长达30天。

● Hibernate®培养基是一个合适的运输介质运输各种组织和生物标本，包括脐带组织。

● 添加了B-27的Hibernate®培养基用于在37°C和环境CO₂中短期维持培养的大鼠神经元（最长2天），从而实现方便的台式实验。

Neurobasal® Medium 推荐用于原代大鼠神经元培养。Hibernate®和Neurobasal® Media在使用前必须补充L-谷氨酰胺或GlutaMAX™-I和B-27补充剂。

(1) 无菌加入2.5 mL/L(0.5 mM) GlutaMAX™-I。

(2) 无菌添加20 mL/L(2%)B-27

注：对于原代大鼠海马神经元培养，在培养第四天之前，完整的Neurobasal® Medium 需要额外补充25uM (3.7μg/mL) L-谷氨酸。一旦补充，完全培养基za在2°至8°C避光条件下可稳定保存长达一周。

(1) 添加2毫升B-27的Hibernate®-E（产前）或Hibernate®-A Medium（产后）于15毫升离心管中。

(2) 解剖海马或皮层，并将海马对放入离心管中（一对/2ml）

(3) 将离心管侧放，避光放置在2°至8°C中，保存时间可长达一个月。

(4) 取出组织并处理（参见神经元细胞的分离）。

以下操作适用于培养的18天胚胎大鼠海马或皮层神经元。初级神经元细胞会附着在裸露的塑料和玻璃器皿上，为了最大化细胞的恢复和收得率，建议在使用前用完整的Neurobasal®/B-27培养基预冲洗所有塑料和玻璃器皿。

(1) 在胚胎孕育第18天（E18）时解剖大鼠皮层或海马对。

(2) 将组织收集在含Hibernate®-E完整培养基的无菌离心管中。将组织放入此管中（每对/2毫升），直到所有解剖工作完成。

(3) 允许组织沉淀到管底。小心地去除上清液，只保留被最少量培养基覆盖的组织。

(4) 在不含Ca²⁺的Hibernate®-E培养基中（Transnetyx Tissue，Cat. No. HE-Ca）加入2毫克/毫升经过过滤灭菌的泛酶，以30°C酶解组织30分钟，每5分钟轻轻摇动管子一次（每2对/毫升）。

(5) 使用2倍体积的Hibernate®-E完整培养基恢复二价阳离子。

(6) 允许未分散的组织沉淀2分钟，然后将上清液转移到无菌的15毫升离心管中，以150 × g离心5分钟。

(7) 用1毫升完整Neurobasal®培养基轻轻悬浮沉淀物，并取一部分进行细胞计数。使用Countess®自动细胞计数器确定活细胞密度。

(8) 在聚-D-赖氨酸涂层的48孔板中每孔培养约1 × 10⁵个细胞（或所需的细胞密度）。通过添加Neurobasal®完整培养基将细胞悬浮液稀释至每孔500μL。

(9) 在含5% CO₂的细胞培养箱中37°C孵育。注意：5% CO₂在空气中是可以接受的，但5% CO₂和9%氧气更可取。

(1) 使用50μg/mL聚-D-赖氨酸溶液（0.15 mL/cm²）涂覆培养表面（细胞培养级），孵育一小时或过夜。

(2) 用PBS对培养表面进行2次冲洗。

(3) 将培养皿暴露在无菌环境中（例如，层流罩）直到干燥。

在此过程中任何时候不要涡旋或离心细胞，因为细胞在从冷冻保存中恢复后非常脆弱。此外，重要的是在使用前用完整培养基冲洗每个移液器尖和管/瓶，以最小化细胞与塑料的粘附。

建议一次解冻一个细胞小瓶。小瓶应立即从液氮存储转移到37°C的水浴中，最小化处理时间。在一个冰桶中使用少量液氮将小瓶从液氮转移到水浴中。使用镊子转移小瓶。

(1) 用预热（37°C）的完整Neurobasal®培养基冲洗一个15毫升离心管，并在解冻细胞前放在操作台中。

(2) 如果从液氮存储中取出小瓶，请稍微扭开盖子以释放压力，然后重新拧紧盖子。

(3) 在37°C水浴中轻轻旋转冻结的小瓶快速解冻（<1分钟）。当只剩下一个微小的冰晶时从水浴中取出。

(4) 将小瓶转移到细胞操作台，并用70%异丙醇消毒小瓶。在罩表面的底部轻轻敲击小瓶，使液体沉积在小瓶底部。

(5) 用Neurobasal®完整培养基润洗移液器尖端，并非常轻柔地将细胞转移到预冲洗的无菌15毫升离心管中。

(6) 用预热的Neurobasal®完整培养基冲洗小瓶，加入滴定，每秒一滴，一次只加一滴，轻轻旋转混合细胞。不要一次将全部培养基加入管中，这可能导致渗透性休克而降低细胞活力。

(7) 滴定地向管中再加入2毫升Neurobasal®完整培养基（总悬浮液体积为4毫升）。

(8) 使用Countess®自动细胞计数器确定活细胞密度。

(9) 在每孔中培养约1 × 10⁵个细胞（或所需的细胞密度）在聚-D-赖氨酸涂层的48孔板中（请参见用Poly-D-赖氨酸涂覆培养表面）。通过添加Neurobasal®完整培养基将细胞悬浮液稀释至每孔500μL。

(10) 在含5% CO₂湿润大气中37°C孵育。注意：5% CO₂在空气中是可以接受的，但5% CO₂和9%氧气更可取。

(11) 培养4-24小时后，从每个孔中吸取一半培养基，并用等体积的新鲜预热的完整培养基替换。放回培养箱。

(12) 在5%CO₂(9%O₂)中37°C培养4天后，从CO₂培养箱中取出培养物。将整个培养基更改为已预热的Hibernate-E完整培养基。

注：一旦置于Hibernate培养基中，细胞在CO₂培养箱外可在37°C下保持长达2天。应注意防止培养物脱水。