【Merck】IHC高背景的原因和解决方案

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Merck IHC

1. 抗体使用浓度过高

参考抗体说明书中的建议稀释比进行实验。如果背景还是较高，可以适当提高抗体稀释比例。

2. 样本内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶干扰

使用常见酶标二抗底物（过氧化物底物 DAB，碱性磷酸酶底物 NBT/BCIP）进行化学显色时，样本中内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶可能造成高背景信号。

对于过氧化物酶，可以使用 3%H₂O₂ 溶液在室温下处理样本 10-15min。

对于碱性磷酸酶，在显色底物中加入 1mM 左旋咪唑可以抑制内源性碱性磷酸酶。

3. 二抗与样本非特异结合

使用与二抗物种来源相同的血清来对样本进行封闭处理。比如，如果二抗是山羊来源，使用 10%正常山羊血清进行封闭。

4. 一抗与样本物种来源相同

当一抗物种来源于检测样本物种相同时，样本中内源 IgG 可能会被二抗检测到导致高背景，比如常见的使用小鼠一抗检测小鼠样本（mouse-on-mouse IHC）。

可以在封闭步骤中，使用未标记的 anti-mouse IgG Fab 段抗体对内源 IgG 进行封闭。

5. 组织没有充分清洗

在抗体孵育和显色步骤后，用 1xPBS 溶液至少清洗 3 次，每次 2-5min。

6. 组织在组化过程中变干燥

整个 IHC 实验过程需在湿盒中进行，避免样本干燥。

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发布日期：2024-03-21 16:37:06
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